ГЛАВА V
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Наряду с качественным анализом в микробиологической практике используется и количественный микробиологический анализ, который состоит в определении количества микроорганизмов в единице объёма исследуемой среды.
Этот метод чаще всего применяется при микробиологическом контроле производственных процессов, а также в области гигиены, санитарии и при решении различных теоретических вопросов.
Сам процесс подсчёта микроорганизмов осуществляется различными способами и не представляет особых затруднений.
Наибольшее внимание следует обратить на отбор образца для анализа. Все методы количественного микробиологического анализа сводятся к следующему: 1. Метод счёта колоний. 2. Метод прямого счёта микроорганизмов.
МЕТОД СЧЁТА КОЛОНИЙ
Этот метод основан на том, что из каждой клетки микроба, попавшей на поверхность твёрдой стерильной питательной среды, развивается отдельная колония. При достаточном разведении культуры эти колонии располагаются на некотором расстоянии друг от друга, что даёт возможность подсчитать их. Зная объём жидкости, взятой для посева, и пересчитав количество выросших колоний, можно высчитать количество микроорганизмов в любом объёме жидкости.
Для посева применяют микропипетки различного объёма, предварительно стерилизованные. Если в исследуемой среде содержание микроорганизмов небольшое, то посев производят без предварительного разведения. При большом содержании микроорганизмов производят разведение в 100 и более раз. Во всяком случае, стремятся развести на столько, чтобы в чашке Петри выросло не более 200 колоний. В том случае, когда мы не знаем, много ли микроорганизмов содержится в среде, производят посев разных количеств и при различных разведениях и делают затем подсчёт только в чашках, где выросло не более 200 колоний.
Рис. 63. Лупа для подсчёта колоний.
Посев производят в расплавленную агаровую среду с температурой не выше 52° Поскольку эта температура всё же довольно высокая, то удобнее всего производить посев в комбинированную агаро-желатиновую среду, температура застывания которой ниже. После посева чашки Петри помещают в термостат дном кверху для выращивания микроорганизмов. За прорастанием следят ежедневно, на 3—4-е сутки подсчитывают колонии.
Для облегчения подсчёта чашку помещают на тёмную поверхность, а сверху накрывают листом бумаги, который постепенно передвигают. При большом количестве колоний для облегчения подсчёта дно чашки делят тушью или восковым карандашом на участки и ведут подсчёт отдельно для каждого участка. Для подсчёта колоний применяют специальные лупы, а также счётные аппараты. Счётный аппарат Вольфюгеля позволяет подсчитать число колоний на 1 см2.
Подсчёт производят в 10—20 см2 и полученное среднее умножают на общую площадь данной чашки. Этот метод применяется на всех стадиях микробиологического контроля виноделия при определении общего количества микроорганизмов. На нём основан также анализ воздуха и воды.
АНАЛИЗ ВОЗДУХА
Самым простым способом микробиологического анализа воздуха является метод оседания, предложенный Кохом. Он основывается на том, что при спокойном состоянии воздуха содержащиеся в нём микроорганизмы постепенно оседают на твёрдые поверхности. Скорость оседания прямо пропорциональна величине микроба.
Рис. 64. Прибор Вольфюгеля для счёта колоний.
Быстрее всего, однако, оседают бактерии, так как, хотя они и малы, но обычно соединены группами. Медленнее всего оседают споры бактерий. Дрожжей в воздухе содержится мало. Обычно за 20—30 минут на твёрдые поверхности оседает большая часть микроорганизмов, содержащихся в воздухе.
Техника анализа воздуха такова. В две стерильные чашки Петри наливают твёрдую питательную среду. После того как она хорошо застынет (через два часа), переносят чашки в исследуемое помещение, ставят на ровную поверхность и открывают чашки на определённый срок (5—10—15минут). Количество осевших микроорганизмов будет прямо пропорционально времени, в течение которого чашка была открыта, и содержанию микроорганизмов в воздухе.
При анализе воздуха на винодельческих предприятиях посев производят на разные питательные среды — сусло-агар и бульон-агар, — так как на первом лучше прорастают плесени, а на втором бактерии. Чашки помещают в термостат при температуре 22° для проращивания; через 3—5 дней подсчитывают выросшие колонии. Находят среднее для двух чашек. Затем производят пересчёт содержания микроорганизмов на 100 см2 площади по формуле:
где X — количество микроорганизмов, осевших за время т на площади 100 см2;
π — количество выросших колоний;
R — радиус чашки Петри.
Поскольку чашки Петри довольно стандартны, то площадь их можно принимать за 75 см2.
Пересчёт на содержание микроорганизмов в определённом объёме воздуха производят исходя из того, что за 5 минут на площадь в 100 см2 оседает столько же микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Данные, получаемые по этому методу, относительны.
Для более точного определения содержания микроорганизмов в воздухе просасывают определённый объём воздуха через стерильную жидкость — воду или бульон — или через расплавленную твёрдую питательную среду. При этом микроорганизмы, содержавшиеся в пропущенном воздухе, переходят в жидкость и при посеве последней прорастают. Для улавливания микроорганизмов из воздуха служат приборы различной конструкции. Самым простым из них является пробирка, закрытая пробкой, через которую пропущены две изогнутые трубки — короткая отводная и длинная приводящая. Конец приводящей трубки оттянут так, чтобы он пропускал лишь мелкие пузырьки.
Пробирку до половины заполняют питательной средой. Наружные концы стеклянных трубок закрывают ватными пробками и прибор стерилизуют. Стерилизованный прибор присоединяют к аспиратору и через него медленно пропускают определённый объём воздуха. Затем жидкость из пробирки высевают на твёрдую питательную среду. Если же в пробирке была твёрдая питательная среда, то её тут же выливают в стерильную чашку Петри и проращивают.
