ГЛАВА VI
РАСПОЗНАВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
РАСПОЗНАВАНИЕ БАКТЕРИЙ
Определение рода и вида бактерий является одной из трудных задач микробиологии. Это объясняется тем, что бактерии очень легко изменяются под влиянием внешних условий. Поэтому для их распознавания надо пользоваться большим числом признаков — микроскопических, физиологических и культуральных.
К микроскопическим признакам относятся форма, размеры, наличие капсул и цепочек, способность к спорообразованию, расположение спор, наличие подвижности и жгутиков, характер их расположения.
К физиологическим признакам относятся:
- Способность питания (сапрофиты, паразиты, автотрофные микроорганизмы).
- Отношение к кислороду — аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы.
- Отношение к желатине — способность разжижать её, а также форма разжижения (послойная, воронкообразная, мешковидная), характер роста на желатине по уколу (нитевидный, конусовидный, чётковидный, волосистый, ветвистый).
- Способность восстановления нитратов с выделением нитритов и газа или только нитритов, или без выделения нитритов и газа.
- Диастатическое действие — способность вырабатывать крахмал.
- Хромогенез — окраска колоний на агаре, которая бывает бесцветная, флуоресцирующая, фиолетовая, голубая, зелёная, жёлтая, оранжевая, красная, бурая, розовая.
- Отношение к сахарам — способность сбраживать глюкозу, лактозу, сахарозу и др. сахара с образованием различных продуктов (кислоты и газа, кислоты без газа, без кислоты и газа, а также этилового и других спиртов).
- Действие на молоко — свёртывание, образование кислоты, пептонизация (растворение свернувшегося казеина).
К культуральным признакам относятся:
- Штрих по агару — рост обильный, умеренный, бедный или вовсе отсутствует.
- Штрих по картофелю — поверхность слизистая, гладкая (блестящая или матовая) или морщинистая.
- Колонии на агаре. Они могут иметь форму точки, кружка, ризоидов, нитчатую или неправильную.
- Колонии на желатине. Отмечают рост в высоту: стелющиеся, приподнятые, выпуклые, каплевидные, кратеровидные, углублённые; структура — бесструктурные, зернистые, волокнистые, складчатые, концентрические.
- Развитие на бульоне — наличие плёнки, её характер, образование мути или осадка, образование индола (по красному окрашиванию от реактива Эрлиха)
- Происхождение — откуда выделена колония.
Микроскопические признаки выясняются путём микроскопического изучения микроорганизмов. Способ питания выясняется путём культивирования на искусственных питательных средах. При работе с паразитами желательно выяснить степень их патогенности. Методы определения патогенности бактерий описаны в руководствах по медицинской микробиологии.
Для выяснения отношения к желатине делают прививки в желатину, налитую высоким слоем в пробирки при помощи длинной прямой платиновой иглы уколом от поверхности до дна пробирки. Выдерживают затем пробирки при температуре не выше 22° При этом выясняют способность разжижать желатину (бактерии, не образующие протеолитических ферментов, не изменяют желатину), форму разжижения, характер роста по уколу.
Рис. 68. Формы разжижения желатины.
Рис. 69. Характер роста по уколу:
А — гвоздём; Б — лентовидный; В — чётковидный, Г — ветвистый.
Отношение к кислороду выясняют при помощи таких же культур уколом. При этом для разжижающих желатину форм применяют культуру на агаре. Аэробные бактерии развиваются преимущественно на поверхности среды, тогда как анаэробные устремляются в глубь среды, давая различные формы роста.
Для определения способности восстанавливать нитраты делают посевы в жидкую среду, содержащую 1%-ный азотнокислый калий. Перед стерилизацией опускают в пробирку кверху дном маленькую пробирочку (поплавок). Она должна быть заполнена средой так, чтобы в ней не осталось пузырьков воздуха. После посева пробирки выдерживают в течение 2—3 суток при оптимальной температуре.
Рис. 70. Характер роста по штриху на косом агаре: А — умеренный; Б — бедный; В, Г — богатый.
Рис. 71. Отношение бактерий к кислороду:
А — аэробы; Б — факультативные; В — анаэробы.
Выделившийся газ накопится в поплавке. Об образовании нитритов судят по реакции с кали-йод-крахмалом и серной кислотой. Для этого в пробирку с культурой добавляют по 2—3 капли 0,5%-ного раствора йодистого калия, 1%-ного крахмального клейстера и серной кислоты. При наличии нитритов появляется устойчивое синее окрашивание. Предварительно следует проверить, не появляется ли такое окрашивание в результате смешивания самих реактивов с незасеянной питательной средой.
Окраска колоний (хромогенез) определяется при посеве на косом агаре, однако желательно изучение окраски и на других питательных средах.
Диастатическое действие бактерий определяют путём посева их в чашки Петри на мясопептонный агар, смешанный перед застыванием в чашках со стерильным крахмальным клейстером. Чашки выдерживают в термостате. Поверхность питательной среды заливают раствором Люголя (йод в йодистом калии). Если бактерии осахаривают крахмал, то вокруг колоний исчезает синяя окраска. Иногда она исчезает по всей чашке, что доказывает большую интенсивность диастатического действия.
Для установления способности бактерий сбраживать различные сахара пользуются культурами на бульон-агаре с добавлением одного процента исследуемого сахара или на бульоне, содержащем такое же количество сахара. Посевы делают в незастывший агар, налитый до половины пробирки.
Для определения способности к образованию кислот к среде добавляют индикатор на кислоту, например метилрот. О выделении газа свидетельствуют пузырьки, разрывающие на куски твёрдую среду. При использовании жидкой среды применяют поплавок, в котором накапливаются газы.
Действие бактерий на молоко изучают путём посева их в пробирки со стерильным обезжиренным молоком,
подкрашенным несколькими каплями лакмуса. Пробирки выдерживают в термостате и отмечают, на какой день наступило свёртывание, изменение цвета лакмуса или его обесцвечивание, или произошла пептизация.
Форму колоний и характер роста на агаре описывают в процессе выделения культуры, характер роста на картофеле — по специальной культуре. В качестве питательной среды используют неразваривающийся картофель, который очищают, нарезают кусочками или ломтиками и стерилизуют в пробирках или чашках Петри на специальных подставках, чтобы вода, выделяющаяся при варке, не касалась картофеля. Стерилизацию производят в автоклаве или три раза в кипятильнике.
Развитие на бульоне описывают по культуре, предназначенной для определения способности восстанавливать нитраты.
Для определения способности образовывать индол используют специальную культуру на бульоне с прибавлением пептона, полученного из казеина и содержащего триптофан. После двух-трёхдневного выдерживания в термостате производят реакцию на индол: к 10 мл бульонной культуры добавляют 5 мл реактива Эрлиха (парадиметил 4 г, спирт 96° — 380 мл, НС1 конц. — 80 мл). В присутствии индола появляется красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству индола.
Если окраска выражена недостаточно, приливают немного изоамилового спирта, который, извлекая окраску, делает её более заметной. Сумма полученных признаков даёт возможность с помощью определителя бактерий установить их род и вид. В частности, определитель бактерий и актиномицетов создан Н. А. Красильниковым, а также и другими авторами.
