Метод счёта колоний имеет ряд недостатков. С его помощью можно учесть только сапрофитные формы, развивающиеся на искусственных питательных средах. Нитрофицирующие бактерии, серобактерии, паразиты, не прорастающие на искусственных питательных средах, не могут быть учтены. Кроме того, бактерии часто соединены группами, поэтому мы не можем знать, из какого числа клеток развилась колония. Замечено, что чем энергичнее и продолжительнее встряхивали взятую пробу перед анализом, тем больше развивается колоний. По-видимому, при этом имеет место раздробление групп бактерий.
Что же касается количественного микробиологического анализа грибов, то метод счёта колоний для них вовсе не приемлем. Ведь если у бактерий каждая клетка представляет собою индивидуум, размножающийся делением, то у грибов каждый индивидуум производит сотни тысяч спор, служащих для размножения. Поэтому при работе с грибами для установления степени их развития определяют общий вес выросшей грибной массы.
Единственным методом изучения грибов является непосредственное микроскопическое исследование. Когда же нас интересует содержание спор (при анализе воздуха), метод счёта колоний имеет определённое значение. Для более крупных микроорганизмов, таких как дрожжи, давно применяется метод прямого счёта в поле зрения микроскопа. Что же касается более мелких форм — бактерий, то этот метод представляет затруднения, так как их трудно разглядеть. Метод прямого счёта клеток в поле зрения используется для определения группового состава микроорганизмов, их процентного соотношения.
Для подсчёта микробов на предметное стекло помещают каплю исследуемой жидкости, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Подсчёт производят в 10 полях зрения, в разных местах препарата.
Подсчитывают отдельно количество винных дрожжей, диких дрожжей, спор плесеней и бактерий (отдельно уксуснокислых и молочнокислых). Общее число подсчитанных клеток делят на 10. Так получают общее число клеток и процентное отношение между отдельными группами микробов.
Недостатком этого метода является то, что он не даёт возможности определить количество микроорганизмов в единице объёма исследуемой среды. Чтобы получить эту величину, используют метод подсчёта клеток в счётной камере. Последняя представляет собою толстое предметное стекло с нанесёнными на нём поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка разделена продольной прорезью на две части. По обе стороны этой бороздки выгравированы сетки различных систем. Средняя площадка на 0,1 мм (в некоторых камерах на 0,2 мм) ниже двух боковых. Таким образом, под покровным стеклом, которым покрывается сетка, создаётся слой жидкости высотой в 0,1 мм.
Сетки бывают различных систем: Тома, Горяева, Бюркера и др. Однако принцип всех видов сеток один и тот же. Они разделены на то или иное число квадратов, различным образом сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является «малый квадрат» с площадью 1/400 мм2. Большой квадрат всегда соответствует 16 малым.
Рис. 65. Счётная камера Горяева.
Рис. 66. Счетная камера Тома Цейсса.
Опишем подробно сетку Горяева. Её площадь 9 мм2, а объём 0,9 мм3. Она разграфлена на 225 больших квадратов — 15 рядов по 15 квадратов в каждом. Каждый третий ряд в вертикальном и горизонтальном направлениях разграфлён на маленькие квадраты. Площадь большого квадрата 1/25 мм2
Счётная камера Тома-Цейсса отличается тем, что на средней площадке покровного стекла выгравирована сетка площадью в 1 мм2, разделённая на 400 квадратиков. Площадь каждого квадратика — 1/400 мм2, а объём жидкости над ней — 1/4000 мм3. Как и в сетке Горяева, малые квадраты сгруппированы по 16 в большие квадраты ёмкостью 1/25 мм3. Большие квадраты разделены тройными линиями. Если подсчёт ведут в малых квадратиках, то количество микробов вычисляют по формуле:
где X — количество дрожжевых клеток в 1 мл;
а — количество клеток в определённом объёме камеры;
б — количество сосчитанных маленьких квадратиков; в — величина предварительного разведения среды.
При подсчёте количества дрожжевых клеток следует приостановить размножение дрожжей и способствовать разделению комков на отдельные клетки. Это осуществляется прибавлением разбавленной серной кислоты. К 1 мл взвеси дрожжей добавляют 5 мл серной кислоты, разбавленной 1:5. Взбалтывают и каплю жидкости наносят сухой стеклянной палочкой на сетку. Накрывают специальным покровным стеклом (18 на 18 мм), которое прикладывается к счётной камере и притирается к предметному стеклу.
Дрожжевым клеткам дают осесть в течение нескольких минут и затем приступают к подсчёту. Последний можно производить как при малом (120), так и при большом (600) увеличении. Подсчёт производят в 10 больших квадратах, разграфлённых на малые квадраты. Считают 5 больших квадратов по горизонтали и 5 по вертикали. Клетки, лежащие на линиях, разделяющих малые квадраты, считают только один раз.
Клетки, лежащие на пограничных линиях большого квадрата, считают в том случае, если большей своей частью они расположены внутри квадрата. Пересчитав общее число клеток в 10 больших квадратах, над которыми объём жидкости составляет 1/25 мм3 (в камере Горяева), производят пересчёт на 1 мл, т. е. 1 см3. Для этого полученное число умножают на 25000. Если было сделано предварительное разведение, то умножают и на него. Подсчёт производят в двух, а иногда и в трёх препаратах.
Пример расчёта. Среднее количество дрожжевых клеток в 10 больших квадратах составляет 600. Разбавление сделано в 5 раз. Содержание клеток в одном мл исходного материала будет составлять 600-5-25 000 = 75 000 000.
СЧЁТ БАКТЕРИЙ
Бактерии значительно мельче дрожжей, поэтому их счёт более затруднителен. Определённое количество продукта (отмеренное или отвешенное) разводят в определённом количестве стерильной воды. От полученной взвеси отбирают микропипеткой 0,01 мл и размазывают на предметном стекле на площади в 4 см2. Препарат высушивают в эксикаторе, заливают слабым раствором агара (0,1%), снова высушивают таким же образом, затем фиксируют абсолютным спиртом 2—3 минуты. (Абсолютный спирт готовят, выдерживая этиловый спирт-ректификат не менее 4—5 дней в склянке с притёртой пробкой, в которую положен пакет из фильтровальной бумаги, содержащий прокаленную сернокислую медь). Фиксированный препарат окрашивают в течение 1/2 часа карболовым эритрозином, промывают слабой струёй воды, подсушивают и рассматривают в иммерсионном объективе.
Подсчёт производят в 10 полях зрения, в различных частях мазка. Затем определяют площадь поля зрения, измерив его диаметр при помощи объективного микрометра. Зная объём жидкости, взятой для анализа, площадь мазка, площадь поля зрения и среднее количество бактерий в одном поле зрения, легко вычислить содержание бактерий в 1 мл жидкости, а учитывая и разбавление — в единице объёма или веса исследуемого продукта. Королёвым предложен более простой метод счёта бактерий, разработанный им для анализа молока. Приготовляется стандартная суспензия дрожжевых клеток, содержащая 10 млн. клеток в 1 мл (Королёв применяет дрожжи Schizosaccharomyces Pombe).
Суспензия консервируется фенолом и может сохраняться очень долго. Титр взвеси устанавливают путём подсчёта клеток в счётной камере и последующего разведения исходного материала.
Счёт бактерий производят следующим образом. На предметное стекло наносят рядом две одинаковые капли — одну взвеси дрожжей, а другую — исследуемой жидкости. Капли соединяют, перемешивают и размазывают. После подсушивания и окрашивания метиленовой синью подсчитывают отдельно клетки дрожжей и бактерий в 10, 20 или 40 полях зрения. Если в 10 полях зрения найдено 50 дрожжевых клеток, а клеток бактерий 650, то в 1 мл будет содержаться бактерий: 
МЕТОД МЕМБРАННЫХ УЛЬТРАФИЛЬТРОВ
Мембранные ультрафильтры представляют собою тонкие кружки, диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм. По своей водопроницаемости, зависящей от диаметра пор, фильтры делятся на серии, обозначаемые номерами от 1 до 5. Чем больше номер, тем крупнее поры и больше проницаемость. Если в исследуемой среде имеется значительное количество взвешенных частиц, то сначала производят предварительную фильтрацию через обычный бумажный фильтр. Можно применять прибор с двумя последовательными фильтрами, из которых первый — предварительный, а второй — основной бактериальный фильтр.
Перед употреблением фильтры вынимают из упаковки, проверяют их целостность и раскладывают на листе бумаги глянцевой стороной кверху. На краях фильтров ставят метки тушью пли простым карандашом. В сухом виде ультрафильтры можно хранить не более года, т. к. они постепенно теряют эластичность. Для более длительного хранения рекомендуется держать их в 30%-ном водном растворе спирта в склянке с притёртой пробкой, сменяя раствор каждые три месяца. Перед анализом фильтр помещают в стакан с дистиллированной водой, подогревают до 50—60°, сменяя воду 2—3 раза. Затем фильтр кипятят на лёгком огне 2—3 раза по 10—15 минут, сменяя воду.
Рис. 67. Прибор для фильтрования с мембранным фильтром.
Аппаратами для ультрафильтрации служат фильтры Зейца или же специальные фильтры системы Рублёвской насосной станции Московского водопровода. Воронку или стакан фильтровального аппарата и площадку, на которую накладывается ультрафильтр, протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают горящим тампоном. После охлаждения фильтр захватывают стерильным пинцетом, снова проверяют на целостность и накладывают на пластинку фильтровального аппарата, помеченной стороной кверху.
Под ультрафильтром для его предохранения от разрыва рекомендуется положить стерильный бумажный фильтр того же размера, предварительно смоченный стерильной водой (бумажный фильтр стерилизуют сухим жаром). Поверх мембранного фильтра накладывают верхнюю часть аппарата (стакан или воронку), которая плотно закрепляется.
Фильтрующую плёнку можно приготовить следующим образом. В колбочку вносят 6,5—7,0 г киноплёнки, 64 мл безводного ацетона и 36 мл уксусно-этилового эфира. После растворения киноплёнки добавляют 50—56 мл изоамилового спирта,
хорошо перемешивают и фильтруют. Когда исчезнут пузырьки воздуха, выливают смесь на гладкую поверхность чистой стеклянной пластинки, установленной горизонтально. Жидкость растекается по ней и высыхает, образуя белую плёнку, которая легко снимается, если смочить её мокрой ватой.
Из полученной пластинки вырезают ультрафильтр нужных размеров. Перед фильтрацией ультрафильтр смачивают стерильной водой. Затем через него отфильтровывают 10 или 100 мл исследуемой жидкости. Осадок бактерий на фильтре фиксируют формалином, путём просасывания последнего и окрашивают карболовым эритрозином. При этом на фильтре следует поддерживать слабое положительное давление вдувая воздух ртом, чтобы краска не фильтровалась. Окрашивание длится несколько часов. Затем препарат промывают водой путём её просасывания, сушат на воздухе, просветляют кедровым маслом и просматривают в иммерсионном объективе. Подсчёт и расчёты производят, как это указано для стекла (счётной камеры).
§ 6. АНАЛИЗ ВОДЫ
Количественный микробиологический анализ воды можно осуществить различными методами. Для этого пригоден и метод счёта колоний. В зависимости от обсеменённости воды производят посев на твёрдую питательную среду в чашках Петри таким количеством воды, чтобы в нём содержалось не более 100—200 клеток. Для этого используют метод разведений. В несколько стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильной воды. В первую пробирку добавляют 1 мл исследуемой воды и получают разведение 0,1. После взбалтывания 1 мл из первой пробирки переносят во вторую и получают разведение 0,01. Таким образом продолжают разведение до тех пор, пока 1 мл не будет содержать примерно 100—200 клеток.
Посев делают из нескольких разведений, высевая по 1 мл в чашки Петри с твёрдой питательной средой. При исследовании питьевой воды делают два посева: без разведения и с разведением 0,1. При анализе более загрязнённой воды делают посевы из разведений 0,01 и 0,001.
Кроме метода счёта колоний, можно определить число бактерий в воде методом прямого счёта. Для этого удобен метод ультрафильтрации бактерий на мембранном фильтре.
§ 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА МИКРООРГАНИЗМОВ
Для определения доброкачественности воды большое значение имеет определение содержания в ней клеток кишечной палочки (коли-титр). Это содержание служит санитарным показателем доброкачественности воды и пригодности её для питья. В этом случае не применимы ни прямой счёт, ни метод счёта колоний и выдвигается новый метод количественного анализа — определение титра микроорганизмов.
Этот метод сводится к посеву исследуемого материала (после его разведения, если это необходимо) на элективные питательные среды. Вывод делают по результатам биохимической деятельности определённой группы микроорганизмов (накопление спирта, молочной кислоты, уксусной кислоты и пр.). Здесь возможны и ошибки, так как аналогичную деятельность может проявить п другая физиологическая группа.
Для определения титра кишечной палочки используют жидкую среду Булира: к 1 л мясного бульона добавляют 25 г пептона, 15 г хлористого натрия и 25 г лактозы, нейтрализуют содой до pH 7,2—7,4 и стерилизуют. Среду наливают в бродильные сосуды так, чтобы замкнутое колено было целиком заполнено. Если нет бродильных сосудов, то среду наливают в большие пробирки по 5 мл и в них опускают вверх дном маленькие пробирки.
При посеве малых объёмов жидкости среду разбавляют стерильной водой 1 3. При посеве больших объёмов жидкости разведения не производят. Бродильные сосуды или пробирки выдерживают в термостате при температуре 37—44° и через 1—2 дня отмечают наименьшее разведение, которое вызвало помутнение и образование газов. Поскольку образование газов может быть обязано и другим физиологическим группам, то для большей достоверности из забродивших колб делают посевы на агар Эндо. К 100 мл бульона-агара прибавляют 1 г лактозы, 1 мл 10%-ного раствора соды. Перед употреблением добавляют 0,5 мл насыщенного спиртового раствора фуксина и 2,5 мл свежеприготовленного 10%-ного водного раствора химически чистого сернистокислого натрия.
Среда должна быть бледно-розовой. Если она получилась тёмно-красной, к ней следует добавить 1—2 мл раствора сернистокислого натрия. Хранить среду можно 1—2 дня в тёмном месте на холоде.
При помощи фламбированной петли захватывают каплю забродившей жидкости, стряхивают и затушёвывают ею всю поверхность среды, предварительно хорошо застывшей в чашке Петри. Чашки выдерживают при 37° в течение 24 часов. Колонии кишечной палочки на среде Эндо красного цвета с зеленоватым металлическим блеском. Питательная среда вокруг них также краснеет.
Для выявления кишечной палочки пригоден и метод ультрафильтрации. При этом фильтр с нефиксированными бактериями накладывается на среду Эндо в чашке Петри и проращивается. Колонии вырастают на фильтре, однако имеют вполне типичный вид.
