Руководство по микробиологии виноделия - Питательные среды

ГЛАВА IV
МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
В микробиологической практике, наряду с микроскопированием, большое значение имеет культивирование, или выращивание микроорганизмов. Оно применяется как при качественном, так и при количественном анализе микрофлоры исследуемой среды, а также при выделении чистых культур и при работах с ними. Для культивирования микроорганизмов используются различные питательные среды.

§ 1. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Состав питательных сред

В качестве питательных сред для выращивания микроорганизмов может применяться любое вещество или смесь веществ, которые обеспечивают нормальное развитие данного микроорганизма. Питательные среды должны содержать все элементы, входящие в состав тела данного микроорганизма.
Химический анализ микроорганизмов показывает, что в их состав входят следующие элементы: углерод, водород, кислород, азот, фосфор, сера, калий, магний и железо. Таким образом, любое вещество, содержащее эти элементы, может быть использовано для культивирования микроорганизмов.
Однако для нормального развития микробов имеет ещё значение, в какой форме находится тот или иной элемент. Дело в том, что из одного и того же соединения одни микроорганизмы могут усваивать нужный им элемент, а другие не могут. Так, например, молекулярный азот воздуха могут усваивать лишь немногие микроорганизмы (азотфиксирующие бактерии), углерод из углекислого газа — только фотосинтезирующие и хемосинтезирующие бактерии. Сапрофитные микробы хорошо усваивают углерод из углеводов, азот из белковых веществ и продуктов их гидролиза. Хуже усваивается ими азот из минеральных солей — аммонийных, нитратов и нитритов. Зольные элементы: К, Р, S, Mg, Fe усваиваются ими в виде фосфорнокислых и сернокислых солей.
В качестве питательной среды может быть использован любой естественный субстрат, на котором микроорганизмы хорошо развиваются в природных условиях. Однако в силу специфичности требований микроорганизмов к условиям питания невозможно создать универсальный субстрат, на котором можно было бы выращивать любые микроорганизмы.
По своему составу питательные среды делятся на естественные и искусственные. Естественные среды состоят из какого-либо природного продукта (молока, виноградного сока и пр.), а искусственные — из смеси ряда веществ. В конце XIX столетия С. Н. Виноградский ввёл понятие об элективных (избирательных) средах. Это такие среды, которые пригодны только для выращивания одной какой-либо группы микроорганизмов, например вино для уксусных бактерий. Пользуясь элективными средами, можно отделить интересующие нас микроорганизмы от всех других форм, им сопутствующих.

Приготовление питательных сред

Наиболее широкое распространение в лабораторной практике имеет мясной бульон и среды, приготовленные из него, на которых способны развиваться почти все сапрофитные формы микроорганизмов. Для улучшения питательных свойств к мясному бульону добавляют пептон, глюкозу и пр. Мясопептонный бульон (МПБ) готовят следующим образом: 500 г обезжиренного, пропущенного через мясорубку мяса заливают одним литром воды, нагретой до 50°, и настаивают в течение 12 часов при температуре 15° или один час при 50°.
Некоторые авторы рекомендуют варить мясо вместе с бульоном в течение двух часов. Варку лучше всего производить в текучем пару (в кипятильнике Коха). Полученный бульон процеживают через марлю или редкую ткань, мясо отжимают. Если мясо только настаивалось, то процеженный настой кипятят в течение 30 минут. Жидкость отфильтровывают через ткань, чтобы отделить свернувшиеся при кипячении белки, а затем ещё раз фильтруют её через бумажный складчатый фильтр и доводят объём кипячёной водой до литра.
К полученному мясному бульону добавляют 5—Юг пептона (первый продукт гидролиза белков) и 5г хлористого натрия. Затем бульон нагревают для растворения пептона, подщелачивают 10%-ным раствором соды или едкого натра до слабощелочной реакции. После этого бульон кипятят в течение 30 минут (в кипятильнике Коха или в автоклаве) и снова отфильтровывают через бумажный фильтр. Если бульон недостаточно прозрачен, то его осветляют при помощи белка куриного яйца. Последний смешивают с холодным бульоном, хорошо взбалтывают и нагревают в автоклаве или кипятильнике Коха. Свернувшийся белок отделяют фильтрованием. Бульон разливают в пробирки или колбы и стерилизуют.
Для получения мясного бульона повышенной питательной ценности при настаивании мяса добавляют немного пепсина и подкисляют соляной кислотой. Благодаря гидролизу белков мяса под действием фермента пепсина, бульон обогащается продуктами гидролиза белков, усвояемыми микроорганизмами. Из мясного бульона можно приготовить ряд специальных сред. Так, например, для выращивания анаэробных микроорганизмов используют глюкозный (сахарный) бульон, для чего к мясному бульону добавляют 1—2% глюкозы. Мясной бульон принадлежит к жидким питательным средам.

Специальные питательные среды

1. Виноградное сусло. В сезон виноделия заготавливают виноградный сок из винограда сахаристостью 17—20% и кислотностью 5—7 г/л. Сусло отфильтровывают, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют. В качестве питательной среды можно применять и сульфитированное сусло. Перед употреблением его десульфитируют путём нагревания в эмалированной кастрюле до 70—80°, при частом перемешивании, до исчезновения запаха сернистого ангидрида.
2. Вакуум-сусло — уваренный при уменьшенном давлении виноградный сок с сахаристостью около 80%. Для приготовления питательной среды его разбавляют водой до сахаристости 18%, если надо, подкисляют, нагревают до кипения и отфильтровывают.
3. Пивное сусло. Его получают с пивоваренного завода, а при необходимости готовят следующим образом: 250 г солодовой муки или смеси её в равных количествах с пшеничной мукой всыпают в один литр воды, нагретой до 55—57°. Выдерживают при этой температуре в течение одного часа, постоянно перемешивая для полного осахаривания крахмала. Когда оставшаяся смесь перестанет синеть от йода, её процеживают через полотно. Полученное сусло разбавляют водой до сахаристости 6—8%.
4. Яблочное сусло. Свежий или десульфитированный яблочный сок разбавляют водой до титруемой кислотности 6 г/л, подсахаривают до 16%, отфильтровывают.
5. Автолизат дрожжей. Его готовят из свежих прессованных дрожжей. 100 г дрожжей помещают в литровую колбу, заливают 600 мл стерильной воды с добавлением 1 г однозамещённого фосфорнокислого калия и 0,1 г сернокислого магния. В колбу добавляют несколько мл хлороформа для подавления развития микроорганизмов и закрывают ватной пробкой, которую сверху обвязывают вощёной бумагой или станиолем для предотвращения испарения. Колбу выдерживают в течение 7—10 суток при температуре 45—47°, а затем кипятят в кипятильнике Коха в течение 20 минут, после чего фильтруют. Фильтрат должен быть прозрачным, без гнилостного запаха. Е. И. Квасников и Г Ф. Кондо рекомендуют разбавить автолизат водой в отношении 1 15. Для улучшения питательных свойств к автолизату следует добавить 2% сахара в виде глюкозы или виноградного сусла по расчёту.
6. Капустная среда. 200 г измельчённой капусты помещают в кастрюлю, заливают 1 л воды и кипятят в течение 10 минут, затем отжимают через двойной слой марли. Жидкость фильтруют и разводят в два раза водой. Затем добавляют 2% глюкозы и 1 % пептона. Среду можно приготовить и из сушёной капусты. Капусту сушат в измельчённом виде при температуре 25—35°, в тени, с притоком свежего воздуха. Для приготовления питательной среды достаточно взять 6—8 г сухой капусты на 1 л воды. Вместо капусты для приготовления питательной среды можно использовать также люцерну или виноградные листья.
7. Вино с глюкозой. Белое сухое молодое вино с содержанием 10—11° спирта подщелачивают едким калием до титруемой кислотности 0,5—1,0 г/л и добавляют глюкозу из расчёта 10 г/л, после чего отфильтровывают.
8. Вино с уксусной кислотой. Белое сухое молодое вино фильтруют, разбавляют водой до содержания спирта 6° и подкисляют концентрированной уксусной кислотой до 10 г/л.
9. Вода с сахарозой. К водопроводной воде добавляют сахарозу из расчёта 100 г/л и растворяют.
10. Дрожжевая вода. 70 г прессованных дрожжей или 10 г сухих дрожжей заливают одним литром воды и кипятят в течение 30 минут. Дают отстояться на холоде и верхний прозрачный слой сливают и отфильтровывают. К фильтрату добавляют 1 л воды, вновь кипятят и фильтруют. При необходимости осветляют яичным белком, как сказано для мясного отвара.
11. Отвар фруктов или овощей. 200 г сушёных овощей или фруктов заливают одним литром воды и оставляют стоять 24 часа, после чего кипятят, твёрдую массу отжимают, жидкость фильтруют.

Твёрдые питательные среды

Жидкие питательные среды имеют ряд недостатков: 1. Они не удобны в обращении. В плоских чашках они легко разливаются. 2. В жидкой среде нельзя увидеть невооружённым глазом посторонние микробиологические загрязнения. 3. При культуре микроорганизмов на жидкой среде отсутствуют такие важные признаки диагностики, как внешняя форма и цвет их колоний. Всех этих недостатков твёрдые питательные среды не имеют. Готовятся они из тех же жидких питательных сред, но с добавлением студнеобразующих веществ — желатины, агар-агара, крахмала.

Желатиновые среды.

Желатин — белок, получаемый при вываривании костей и хрящей. Раствор его при определённых условиях температуры и концентрации затвердевает, т. е., с точки зрения коллоидной химии, переходит из золя в гель. К достоинствам желатина относятся: лёгкость приготовления, хорошее прилипание к стеклу, отсутствие отдачи воды, прозрачность. Культура некоторых микробов на желатине приводит к разжижению последнего, что является важным диагностическим признаком.
Недостатки желатина таковы.

1. Низкая температура плавления (24°), что не позволяет использовать его при выращивании микроорганизмов, требующих более высокой температуры.

Рис. 54. Воронки для горячего фильтрования.

1. Потеря способности к застыванию при перегревании, что затрудняет процесс стерилизации.
2. Желатин не застывает в сильно кислых и щелочных средах. Поэтому жидкие среды перед добавлением желатина должны быть нейтрализованы. Кислые среды нейтрализуют нормальным раствором едкого калия до слабокислой реакции (0,5 г/л по винной кислоте).

Добавляют желатин в количестве 10—12%. Предварительно его замачивают в холодной воде в течение двух часов для набухания. Отжатый желатин добавляют постепенно к жидкой среде, нагретой до 70—80°, при помешивании. После растворения желатина среду кипятят 20 минут.
При необходимости иметь особо прозрачную среду её осветляют яичным белком. Для этого к желатиновой среде, нагретой до 50°, прибавляют по одному яичному белку па каждые 0,5 л среды, взбалтывают и нагревают в кипятильнике Коха до свёртывания всего белка. Среду фильтруют затем через бумажный складчатый фильтр, пользуясь воронкой для горячего фильтрования. Во избежание перегревания желатина сразу после стерилизации погружают пробирки в холодную воду для быстрого охлаждения.

Агаровые среды.

Агар-агар — это смесь полисахаридов, добываемых из морских водорослей. Преимуществом агар-агара перед желатином является высокая температура плавления — 100° Агар-агар не боится перегревания. К недостаткам его относятся: трудность фильтрации (при 40° застывает), неполная прозрачность, плохое прилипание к стеклу, отдача воды. При выращивании в чашках на агаровых средах следует держать чашки дном кверху, чтобы избежать распространения микробов конденсационной водой.
Агар-агар добавляется в количестве 1,5—2,0%. Перед употреблением его вымачивают 3—4 часа в воде, которую меняют через каждые полчаса. К нейтрализованной жидкой среде добавляют набухший агар и кипятят в кипятильнике Коха или в автоклаве до полного растворения агара. Затем быстро фильтруют через слой ваты, пользуясь воронкой для горячего фильтрования. Для осветления агаровой среды применяют яичный белок, который добавляют к охлаждённой до 60° среде, кипятят 30 минут и фильтруют через слой ваты.

Комбинированная среда.

В лаборатории ЦНИЛ ВП Мосгорсовнархоза разработано приготовление твёрдой питательной среды, содержащей 2,5% агара и 5% желатина. Такая питательная среда не отдаёт воды, хорошо пристаёт к стеклу и застывает при температуре 35°

Крахмальные среды.

При отсутствии желатина и агар-агара можно пользоваться крахмалом в том случае, если мутность среды не является препятствием. Крахмал добавляют в количестве 15%. Недостатком крахмальных сред, кроме мутности, является то, что они быстро трескаются.

Разливание питательных сред и их стерилизация

Приготовленные, как сказано выше, питательные среды разливают в колбы или пробирки. Разливать среды следует осторожно, чтобы не смочить верхнего края колбы или пробирки, так как ватная пробка из-за этого прилипнет к стеклу и будет затем выниматься с трудом. Для разливания сред можно пользоваться бюреткой или воронкой, на нижний конец которой надета резиновая трубка с пипеткой и зажимом. Для массового и точного розлива жидких сред удобно пользоваться специальным аппаратом для расфасовки жидкости ТК-2 «ЭМП» отечественного производства.
При употреблении новых пробирок их следует промачивать в слабом растворе соляной кислоты, т. к. стекло отдаёт много щёлочи. Колбы и пробирки закрывают ватными пробками. Перед стерилизацией ватные пробки оборачивают непромокаемой бумагой. Пробирки связывают по 10 штук.
Приготовленные и разлитые питательные среды подвергают стерилизации. Стерилизацией называется полное уничтожение микроорганизмов при помощи высоких температур.

Рис. 55. Автоклав,

Различают влажную и сухую стерилизацию. Влажную стерилизацию производят при помощи пара; стерилизацию текучим паром — в кипятильнике Коха. Последний представляет собою цилиндрический сосуд с двойными стенками. Он сделан из металла и покрыт сверху хорошим термоизолятором (линолеумом, асбестом). Сверху кипятильник закрывается конической крышкой с отверстием для термометра и клапанами для выхода пара. На дно кипятильника наливается вода, а сверху па подставке помещается одно или два ведерка с отверстиями для пара.
В ведёрко помещают колбы и пробирки с питательной средой. Поскольку температура пара не превышает 100°, а внутри сред она будет даже несколько ниже, то однократное нагревание в течение 30—45 минут недостаточно. Для полного обеспложивания питательных сред необходимо провести повторное нагревание их через сутки, а иногда и в третий раз. Такой способ стерилизации называется дробной стерилизацией, или тиндализацией. Он основан на том, что споры микробов, оставшиеся живыми, затем прорастают, а повторная стерилизация убивает их.
Длительность и сроки стерилизации для разных сред различны. Мясной бульон и приготовленные из него среды стерилизуют три дня подряд по 20 минут. Виноградный и яблочный соки стерилизуют два дня подряд по 30 минут, а твёрдые среды из них — два дня подряд по 20 минут. Вино с сахаром и твёрдую среду из него — два дня по 20 минут при 75—80°. 
Автолизат дрожжей и стерильную воду стерилизуют три дня подряд по 30 минут, капустную среду — три дня по 40 минут.
Стерилизация насыщенным паром под давлением производится в автоклаве. Последний представляет собою герметически закрывающийся толстостенный котёл с массивной крышкой. Он снабжён краном для выпуска воздуха и пара, манометром, определяющим давление внутри, и предохранительным клапаном.
На дно автоклава наливают воду, а над ней устанавливают сетку с расположенными над ней стерилизуемыми предметами. Крышку завинчивают герметически и, оставив кран для выпуска воздуха открытым, начинают нагревать автоклав. Когда из крана начнёт выделяться сильная струя пара, кран закрывают и следят за повышением давления пара по манометру. Предохранительный клапан устанавливают так, чтобы при достижении нужного давления он обеспечил выход пара. О температуре в автоклаве судят по величине давления, пользуясь следующей таблицей.


Рис. 57. Сушильный шкаф.

Время, необходимое для стерилизации в автоклаве, зависит также от стерилизуемой среды. Мясной бульон и среды из него стерилизуют при 120° в течение 20 минут; питательные среды, содержащие сахар, — при 112° в течение 20 минут (большая температура может вызвать карамелизацию сахара). Капустную и дрожжевую среды стерилизуют при 121° 30 минут.
После окончания стерилизации дают автоклаву охладиться до тех пор, пока стрелка манометра не упадёт до нуля. Только после этого открывают кран и отвинчивают крышку. Преждевременное открывание автоклава опасно для работающего, а также может привести к бурному вскипанию жидкости в стерилизуемой посуде и к выталкиванию ватных пробок.
Кроме стерилизации нагреванием, применяют и методы холодной стерилизации сред, не выдерживающих высоких температур. Эти методы основаны на (фильтрации питательных сред через обеспложивающие фильтры, которые задерживают видимые в микроскоп микроорганизмы.
Чаще всего применяются фарфоровые фильтры, называемые свечами Пастера-Шамберлана. Нашей промышленностью выпускаются мембранные ультрафильтры с различной величиной пор.
В автоклаве, кроме питательных сред, можно стерилизовать стеклянную посуду, приборы, материалы, а также производить стерилизацию текучим паром при незавинченной крышке. Однако стерилизацию стеклянной посуды и материалов удобнее проводить сухим жаром в сушильном шкафу. Чисто вымытую п высушенную стеклянную посуду заворачивают в бумагу. Колбы и пробирки предварительно закрывают ватными пробками.
Продолжительность стерилизации зависит от температуры. При
150° она длится два часа, а при 160—170° — один час. Выше 175° нагревать не следует, т. к. при 180° ватные пробки и бумага начинают обугливаться.
Открывать сушильный шкаф следует только после его охлаждения до 70° После стерилизации посуду оставляют завёрнутой в бумагу и разворачивают только перед употреблением. Хранят стерилизованную посуду завёрнутой в сушильном шкафу или в плотно закрывающихся шкафах. Металлические предметы (пинцеты, ланцеты, шпатели, иглы) стерилизуют фламбированием (обжиганием) в пламени спиртовой горелки.

Назначение питательных сред

Мясной бульон и среды из него применяются для культивирования почти всех сапрофитных форм бактерий. Виноградное, яблочное, пивное сусло и среды из них применяются для выделения и изучения дрожжей и плесеней. Виноградное вино применяется при микробиологическом контроле виноградного виноделия, а яблочное — в плодоягодном виноделии. В производстве шампанского резервуарным методом применяют вино с 10% сахара; а бутылочным методом — с 20% сахара (сахарозы). Вино с глюкозой, автолизат дрожжей и капустная среда применяются для выделения бактерий — возбудителей заболеваний вин. Вино с уксусной кислотой — для выделения и изучения уксуснокислых бактерий; вода с сахарозой — для музейного хранения чистых культур дрожжей.

Элективные (избирательные) культуры

В природе микроорганизмы очень редко встречаются в чистом виде, а чаще всего в виде смеси разных видов. Однако изучение их в смеси невозможно, поэтому первоначальным приёмом является выделение их в чистую культуру.
Выделению микроорганизмов в чистую культуру предшествует накопительная (избирательная), или элективная культура. Элективными культурами называют микроорганизмы, выросшие на элективных (избирательных) средах. Каждая элективная среда определяется физиологическими особенностями микроба. Благодаря определённому составу элективной питательной среды, в ней может развиваться только один вид микроба, а другие развиваются слабо или вообще не растут. Так, например, для выделения из почвы бактерий, фиксирующих молекулярный азот, применяют питательные среды, лишённые азота. На среде такого состава могут развиваться только азотфиксирующие бактерии.
Элективные культуры введены в микробиологическую практику С. Н. Виноградским. В настоящее время этот метод получил очень широкое распространение в микробиологии. Таким образом, основной сущностью элективных культур будет накопление какого-либо микроорганизма путём создания благоприятных для него условий, ограничивающих развитие других микроорганизмов.
Однако следует помнить, что элективная культура ещё не является чистой культурой и может содержать различные микроорганизмы. Но благодаря тому, что она содержит преимущественно один микроорганизм, она является удобной средой для дальнейшего выделения чистой культуры. Создавая анаэробные условия, мы исключаем развитие аэробов; выращивая культуры при более высокой температуре, получаем культуры термофильных микробов; создавая кислую реакцию среды, мы исключаем развитие большинства бактерий.