Бактерии, разлагающие сахара и яблочную кислоту.
Названные авторы выделили несколько бактерий и глубоко изучили их физиологические и морфологические особенности, определенно различные; весьма подробно исследовали изменения вина под действием бактерий. Эти исследования объединены в трех1 больших статьях, мало известных во Франции, которые мы детально проанализировали в 1938 и 1939 гг. Здесь мы даем их краткое резюме.
Мюллер-Тургау и Остервальдер выделили из виноградных и плодовых вин ряд бактерий, которые они распределили на три ясно различимые группы, или вида, причем в каждую из этих групп входит по пяти бактерий, более или менее сходных между собой, но относящихся по крайней мере, к различным расам:
- Бактерии первой группы (Bacterium mannitopoeum — f, k, p, q, t) относительно различные, относятся к молочнокислым бактериям, в присутствии левулезы интенсивно образующим маннит и действующим на органические кислоты слабее, чем другие бактерии. К этой группе должен быть отнесен манитный микроб Гайона и Дюбура.
- Бактерии второй группы (Bacterium gracile — a, g, s, i, w), весьма сходные между собой, относятся также к молочнокислым. Опи образуют маннит за счет левулезы и имеют гораздо более хрупкую структуру, чем бактерии первой группы. Образование ими маннита выражено слабее, но зато они обладают громадной способностью разлагать яблочную и лимонную кислоты.
- Микроорганизмы третьей группы имеют форму не палочек, а микрококков, причем имеется не менее двух различных типов микрококков, которые можно рассматривать как два отдельных вида (Micrococcus acidovorax и Micrococcus variococcus — h, m, n, I).
Они также образуют молочную кислоту, но не способны образовывать маннит за счет левулезы. Яблочную кислоту они разлагают столь же интенсивно, как и бактерии второй группы.
- Die Bakterien im Wein und Obstwein und die dadurch verursachten Veränderungen. Centr. f. Bakteriologie. II Abt., B. 36. 1912. — Weitere Beiträge zur Kenntnis der Mannitbakterien im Wein. Centr. f. Bakteriologie. II Abt., B. 48. 1918, — Über die durch Bakterien verursachte Zersetzung von Weinsäure und Glyzerin im Wein. Landwirtschaftliches Jahrbuch der Schweiz, 1919 Краткое изложение этих трех важных работ нами дано в Bulletin de l’Association des Chimistes, 1938. Другие труды о бактериях вина рассмотрены в Progrès agricole et viticole, 1939, где отмечена крайняя путаница в воззрениях более ранних исследователей. Авт,
- В своей работе, относящейся к 1918 г., Мюллер-Тургау и
Остервальдер описали новый вид бактерий, который в отношении одних веществ ведет себя как Bacterium mannitopoeum, а в отношении других — как Bacterium gracile, поэтому он был назван ими Bacterium intermedium.
Все эти микроорганизмы не способны разлагать винную кислоту и ее соли, а также глицерин.
На рис. 1 воспроизведены эти бактерии, выделенные из белого вина с добавленным виноградным соком. Bacterium gracile представлена иногда в виде нитей, более тонких, длинных и более коленчатых.
На рис. 2 схематически воспроизведены (по У. Гайону) различные микроорганизмы, встречающиеся в вине.
Таблица 14
Сравнительное действие бактерий Мюллера-Тургау и Остервальдера
B. mannitopoeum В. Gayonl
В. intermedium В. gracile
М. variococcus
М. acidovorax
Рис. 1. Бактерии Мюллера-Тургау и Остервальдера (увеличение в 1000 раз).
Рис. 2. Микроорганизмы (по У. Гайону. 1899):
1 — бактерии ожирения вина; 2 — бактерии маннитного брожения; 3 — бактерии турка старого; 4 — бактерии турка молодого. а — бактерии пригорка и вина; б — Bacterium uced; в — Mycoderma villi; г — винные дрожжи. Увеличение пп. 1 — 3— в 570 раз, пп. 4 — 8 — в 400 раз.
В табл. 14 в качестве примера приведены данные сравнительных опытов высева чистых культур различных бактерий в виноградный сок и в два раскисленных вина с добавкой небольших количеств виноградного сока.
Кислотность выражена в серной кислоте. Количественное содержание дано в граммах на литр.
Понятно, что эти результаты выражают сумму воздействий каждой бактерии на сахар (смесь глюкозы и левулезы) и на яблочную кислоту. Здесь снова обнаруживаются уже отмеченные выше свойства; как правило, энергичнее всех воздействует на сахар Bacterium mannitopoeum, слабее всех — Micrococcus vario-coccus. Микрококки, в противоположность бактериям, образуют лишь следы уксусной кислоты даже при распаде сахара, но производят сравнительно больше молочной кислоты. При этом наблюдается повышение или понижение общей кислотности. Если преобладает распад сахара, то кислотность увеличивается, а при преобладании распада яблочной кислоты кислотность уменьшается.
Мюллер-Тургау и Остервальдер на одной и той же среде параллельно сравнивали результаты физиологических и морфологических наблюдений над поведением Bacterium mannitopoeum, Bacterium intermedium и Bacterium Gayoni, причем последний являлся маннитным возбудителем Гайона и Дюбура, переданным ими в распоряжение швейцарских исследователей в 1911 г. Нг одном и том же виноградном соке, стерилизованном и раскисленном (свободная кислота 1,25 г/л в пересчете на серную кислоту), который содержал 128 г/л сахара, Мюллер-Тургау и Остервальдер проводили сравнительные испытания всех выделенных ими бактерий и микрококков.
Приводим в качестве примера некоторые результаты (табл. 15).
Таблица 15
Сравнительное действие в раскисленном сусле
В табл. 16 показаны весовые количества уксусной кислоты, молочной кислоты, спирта и маннита, образующихся в результате разложения 100 г сахара в средах с pH около 4,2 (мы устанавливали pH, воспроизводя среды, применявшиеся швейцарскими авторами). Из таблицы видно, что процессы брожения, вызываемые указанными двумя видами бактерий и микрококками, весьма различны. Это, конечно, не случайно, что весовые количества кислот приближаются к 12,5; 25; 50 и 100.
Таблица 16
Разложение сахаров
При разложении декстрозы и левулезы с помощью В. mannitopoeum образуется вещество, имеющее запах ацетамида (мышиный привкус).
Количество образованных кислот (уксусной и молочной) как в присутствии, так и в отсутствии кислорода было почти одинаково; следовательно, все эти организмы не являются ни строго аэробными, ни строго анаэробными; предыдущие утверждения, согласно которым бактерии вина являются анаэробами, следует, конечно, понимать в смысле факультативного анаэробиоза. При отсутствии свободного притока воздуха образуется несколько больше молочной и немного меньше уксусной кислоты.
Если в плодовый сок, в котором бактерии (В. mannitopoeum и В. gracile) развиваются в продолжение нескольких недель, добавить дрожжи, то можно наблюдать в зависимости от скорости размножения бактерий, что в одних случаях бактерии не препятствуют спиртовому брожению, а в других противодействуют полному превращению сахара (1 г уксусной кислоты и 3 г молочной кислоты, по-видимому, служат уже препятствием для спиртового брожения).
С другой стороны, размножение и деятельность самих бактерий то испытывают сильное противодействие, то (что бывает чаще) ускоряются развитием дрожжей, даже если последнее прекращается. В зависимости от условий в присутствии дрожжей и бактерий отмечается более слабое или более интенсивное образование уксусной и молочной кислоты, чем при наличии одних дрожжей.
Неизменно наблюдается, что В. gracile действует на сахар слабее, а на кислоту сильнее, чем В. mannitopoeum.
Наконец, из практики известно, что В. mannitopoeum не способны в обычных условиях разлагать яблочную кислоту, тогда как В. intermedium и в особенности В. gracile обладают этой способностью наряду с микрококками. В. gracile является по преимуществу бактерией разложения яблочной кислоты. Кроме того, все эти бактерии могут вызывать молочное скисание, но В. Gayoni, по-видимому, главным образом распространены в винах, содержащих сахар и малокислотных, как это наблюдается в винах жарких стран (эта бактерия, кстати сказать, была выделена из алжирского вина).
Бактерии, разлагающие глицерин и винную кислоту.
Бактерии вина наиболее легко разлагают сахара и яблочную кислоту. До 1919 г. Мюллер-Тургау и Остервальдер изучали лишь вина, содержащие оба эти вещества вместе или одно из них, и ни один из видов бактерий, выделенных и испытанных ими в искусственных средах, не действовал на винную кислоту и глицерин.
Несмотря на то, что давно уже был установлен факт разложения винной кислоты (1846—1862), Пастер не считал это явление характерным признаком турна и лишь мимоходом упоминает о нем. Впоследствии больными турном называли вина, в которых, как правило, не делалось определения винной кислоты и которые рассматривались как заболевшие турном на основании мути, характера и вкуса вина. Во избежание недоразумения Мюллер- Тургау и Остервальдер отказались от терминов «турн» и «пусс», которые служили для обозначения совершенно различных явлений, и на основании своих наблюдений установили два вида заболеваний:
- распад винной кислоты с разложением глицерина;
- разложение одного лишь глицерина.
Одновременное разложение глицерина и винной кислоты. В десяти красных швейцарских винах, не подвергавшихся каким-либо изменениям, при сравнении с такими же винами, в которых произошло только разложение яблочной кислоты, наблюдалось следующее:
- Увеличение летучей кислотности, достигающее 2,6 г/л (в пересчете на серную кислоту).
- Обычно слабое изменение содержания молочной кислоты, от —0,8 до +0,6 г в литре, за исключением одного случая, когда оно достигало +2.4.
- Разложение всей винной кислоты, примерно 2,3—2,9 г/л, исключая один образец, где винная кислота осталась нетронутой.
- Изменения свободной кислотности составляли от — 0,9 до + 1 г/л.
Поскольку распад 75 мг винной кислоты не может дать более одного эквивалента — 60 мг уксусной кислоты, избыток образовавшейся уксусной кислоты по сравнению с количеством исчезнувшей винной кислоты свидетельствовал о наличии какого-то другого разложения. Параллельно с этим сухой экстракт уменьшался на 5—7 г, и уже было можно предположить, что другим распадающимся веществом является глицерин, что впоследствии и подтвердилось анализом.
Из этих вин авторами были выделены в чистом виде бактерии, способные разлагать в винах и искусственных средах винную кислоту и глицерин и вызывать в красных стерилизованных винах такие же изменения, какие наблюдаются и в нестерилизованных. Эти бактерии представляют собой палочки, не образующие спор, и иногда имеют вид длинных или коротких нитей толщиной 0,8—1 μ и близких. Они относятся к факультативным анаэробам. За счет левулезы они производят маннит и энергично разлагают яблочную кислоту.
Что касается природы образующихся летучих кислот, то подвергшиеся изменению образцы содержали большей частью пропионовую кислоту, но в разных количествах и, как правило, небольших — порядка 15—30%, максимум 40% всей летучей кислотности. В двух винах, явно больных турном, в которых винная кислота была полностью разрушена и даже разложен глицерин, какого-либо образования пропионовой кислоты не наблюдалось. Последняя, следовательно, не характерна для турна, вопреки мнению Дюкло, сделавшего ошибочное обобщение. Швейцарскими авторами не отмечено ни малейшего присутствия масляной кислоты, зато три подвергшиеся изменению образца содержали до 30% муравьиной кислоты.
В то время как за счет винной кислоты не образуется даже и следов пропионовой кислоты, при разложении глицерина, наоборот, она образуется часто в большом количестве, почти равном содержанию уксусной кислоты. Впрочем, авторы делают оговорку, что они исследовали лишь небольшое число видов бактерий, разлагающих винную кислоту и глицерин, и что могут существовать и другие виды с несколько иными свойствами.
С практической точки зрения, если судить по работам швейцарских авторов, все исследованные ими красные вина, взятые вскоре после окончания брожения, подверглись сильному разложению после достаточно длительного хранения при 16°. Это может показаться необычным, но следует заметить, что в эти вина ничего не вносилось, вероятно, их не переливали в окуренные бочки и ни разу не снимали с осадков в продолжение года хранения при 16°; к тому же содержание в них спирта достигало всего 7— 10°; свободная кислотность после разрушения яблочной кислоты была нормальной — 3,5—4,5 г (в пересчете на серную кислоту).
Разложение только одного глицерина. Мюллер-Тургау и Остервальдер наблюдали в красных винах сильный распад глицерина, не сопровождавшийся сколько-нибудь значительным разложением винной кислоты. В семи швейцарских винах, содержавших 6,9 и 10,6° спирта и не содержавших несброженного сахара, они обнаружили:
- увеличение летучей кислотности, достигавшей 0,5 и 1,2 г/л (в пересчете на серную кислоту);
- повышение содержания молочной кислоты от 0,36 до 3,5 г/л;
- отсутствие какого-либо уменьшения процентного содержания винной кислоты, составлявшей 1,6—2,6 г/л;
- уменьшение содержания глицерина, достигавшее 1— 4,3 г/л, которое сопровождалось примерно равным или значительно большим уменьшением сухого экстракта;
- повышение титруемой кислотности, которая составляла от 0,4 до 2 г/л.
В результате разложения глицерина образовалась уксусная кислота вместе с большим или меньшим количеством молочной, которая, в свою очередь, может частично подвергаться разложению бактериями, давая уксусную кислоту. Общее количество образующихся летучих кислот и молочной кислоты равно примерно израсходованному глицерину; впрочем, иногда из значительной части глицерина образуется углекислый газ и вследствие этого от него не остается следов.
Авторам не встречались бактерии, способные разлагать глицерин, не воздействуя при этом на винную кислоту. Они полагали, что такие бактерии должны существовать, так как наблюдаются случаи, когда разложению подвергается только глицерин. В настоящее время нам кажется, что это зависит от условий, в особенности от pH: для разложения винной кислоты требуется весьма слабая кислотность, тогда как распад глицерина возможен при средней кислотности. При повышенном pH винная кислота разложится даже гораздо легче, чем глицерин.
Добавим, что распад глицерина в отличие от разложения винной кислоты сопровождается повышением кислотности.
