Поставленная задача заключается в том, чтобы классифицировать значительное число бактерий, выделенных из осадков различных вин, культивируя их в винах разной кислотности и в искусственных средах, и распределить их в зависимости от их свойств и вызываемых ими химических изменений.
Мы начали с осадков различных здоровых вин, молодых и старых, в которых спиртовое брожение закончилось и которые хранились в деревянных бочках или в бутылках. Из этих осадков нами были введены при помощи твердых сред бактерии, которыми затем асептически засевались разные среды в апреле 1937 г.
Рис. 3. Прибор для выращивания анаэробных бактерий вина
Средой служило одно из высококислотных вин 1936 г. (140 мэкв общей кислотности, 5 мэкв летучей кислотности) с. высоким содержанием яблочной кислоты, которое было несколько нейтрализовано едким натром с целью получить разные значения pH и стерилизовано нагреванием в бутылках емкостью 750 мл, закупоренных обычной пробкой. Температуры нагревания колебались от 54° для более кислотных вин до 62° для менее кислотных.
Таким же образом испытывали культуры в искусственных средах: в дрожжевом соке, в который вносили по 10 г/л винной кислоты, а pH было доведено примерно до 4, и в дрожжевом соке с яблочной кислотой примерно при pH 3,5.
В табл. 18 дана сводка влияния различных бактерий на одно и то же вино. Опыты проводили в пробирках, хранившихся в банках с пирогаллолом (рис. 3), поддерживали температуру 25— 27°; анализы начали через пятьдесят дней.
Для каждого значения pH колонка а показывает уменьшение общей кислотности в миллиэквивалентах в литре сравнительно с контрольным (незасеянным) вином, колонка б— повышение летучей кислотности; в колонке в римскими цифрами отмечена форма бактерий, изображенных на рис. 4 (увеличение в 600 раз). Отсутствие показателей означает, что изменений в вине и, следовательно, развития бактерий не наблюдалось.
В первой колонке фигурируют номера бактерий, сохраняемые в дальнейшем описании. Вторая колонка показывает годы выделки вин, из осадков которых были выделены эти бактерии.
Бактерии от Б1 до Б11, отнесенные к группе М, не оказывали никакого воздействия па винную кислоту и не вызывали почернения вина. Напротив, бактерии от Б12 до Б20, отнесенные к группе Т, во всех пробирках, где они развивались (кроме Б 18 с pH 3,49), полностью разлагали винную кислоту (в некоторых оставались ее следы), сообщая вину черную окраску. Мы остановились на буквенных обозначениях М и Т потому, что первые являются возбудителями яблочно-молочного брожения, а вторые — возбудителями турна.
Выводы. 1. Испытанные бактерии делятся на две большие группы: неспособные разлагать винную кислоту даже при высокой pH и способные разлагать ее при единственном условии, что значение pH не слишком низко. Обе разновидности разлагают яблочную кислоту, но первые воздействуют на нее интенсивнее, т. е. даже в сильнокислотной среде — при pH 3,3, а в некоторых случаях и при pH 3,1.
Таблица 18
Сравнительное действие различных бактерий на одно и то же вино
Примечание. К концу четвертого месяца распад закончился при pH 3,1 у бактерий Б 1, Б 2, Б 3, что же касается остальных бактерий, то никаких следов воздействия не наблюдалось,
- В пределах каждой из этих двух больших групп бактерии можно распределить в зависимости от значения pH, которым обусловлено их действие. В группе М встречаются три разновидности, способные разлагать яблочную кислоту при pH 3,1, при общей кислотности 140 мэкв (или 7 г/л в пересчете на серную кислоту). В группе Т одни начинают действовать при pH 3,49, другие — при pH 3,74; но в действительности значение pH, при котором начинает распадаться винная кислота, должно быть более высоким вследствие распада яблочной кислоты, предшествующего разложению винной кислоты и снижающего активную кислотность.
Рис. 4. Формы бактерий вина.
- Уменьшение общей кислотности в основном определяется сбраживанием всей яблочной кислоты и вследствие этого всегда одинакового порядка независимо от значения pH и разновидности бактерий. При распаде винной кислоты ее израсходование в общем восполняется вновь образующимися кислотами. Увеличение летучей кислотности всегда слабее в группе М, действующей при обычном pH вина, становится заметным при повышении pH и значительным с момента вмешательства бактерий группы Т. В таких случаях оно достигает примерно 1 г/л (в пересчете на серную кислоту).
- Как правило, бактерии группы М по размеру короче бактерий группы Т, и тем короче, чем выше pH. Кроме того, первые вызывают помутнение жидкости, а вторые образуют более или менее обильный хлопьевидный осадок, в общем оставляя жидкость прозрачной. Различия в размерах бактерий не носят абсолютного характера.
- В искусственных средах, приготовленных из дрожжевой воды, поведение бактерий такое же, как и в винах. Это относится как к способным разлагать винную кислоту бактериям, так и к неспособным. И те и другие могут разлагать яблочную кислоту, но бактерии группы Т образуют больше летучей кислотности и должны воздействовать на другие элементы дрожжевой воды или, быть может, на образующуюся молочную кислоту.
- Все эти бактерии в многочисленных опытах, проведенных вслед за описанными выше, на тех же средах или на других вели себя подобным же образом; это относится как к разлагающим винную кислоту, так и к не способным воздействовать на нее. Таким образом, распределение бактерий полностью подтвердилось действительностью и, имея само по себе большое значение, в то же время разрешает целый ряд вопросов, в прошлом спорных.
- Остервальдер любезно предоставил нам в феврале 1938 г. культуру бактерий каждой разновидности, так глубоко изученных им совместно с Мюллером-Тургау. В числе их был маннитный возбудитель Гайона и Дюбура, выделенный и изученный в Бордо в 1894 г. и посланный Гайоном швейцарским авторам в 1911 г. В вышеупомянутом вине при pH 3,74 развивались только В. tаrtаrорhtоrum, вызывая полный распад винной кислоты, в соответствии с наблюдениями швейцарских исследователей, которые отвели этой бактерии особое место и дали ей это название. Другие бактерии способны были развиваться только в еще менее кислотных средах (примерно pH 4), т. е. гораздо менее кислотных, чем нормальные вина, даже в присутствии сахара и яблочной кислоты. Возможно, что их кислотоустойчивость изменилась вследствие последовательного выращивания культур в слабокислых средах — благодаря своего рода отвыканию.
- Испытывая действие некоторых бактерий (Б2, Б4, Б15, Б16, Б17, Б20 и В. tаrtаrорhtоrum) на различные вещества в дрожжевой воде при разных значениях pH (от 3 до 4), мы установили следующее: винная кислота разлагается Б 17, начиная с pH 3,25; Б15 и Б16, начиная с pH 3,5; Б20, начиная с pH 3,75; нами уже было установлено, что развитие Б20 задерживается при высоком значении pH. Яблочная и лимонная кислоты разлагались любыми бактериями из перечисленных; яблочная кислота разлагалась Б2, Б4, Б16, начиная с pH 3; никакое другое соединение при pH 3 не распадалось. Молочная кислота разлагалась только Б 4 и весьма своеобразно. Глицерин разлагался только Б 2 при pH 3,5 и не нацело Б16. Следовательно, винная кислота и глицерин отнюдь не всегда разлагаются бактериями одних и тех же разновидностей, и это обстоятельство, чрезвычайно важное в практическом отношении, должно быть уточнено. Глюкоза и левулеза разлагались всеми из испытанных бактерий при pH от 3,2 до 3,5.
